南京林业大学勇强教授课题组Biotechnol. Adv. 揭开木质素-酶相互作用的秘密：先进分析技术研究进展

摘要

南京林业大学勇强教授课题组在Biotechnology Advances综述了近年来国内外研究木质素酶相互作用的多学科交叉分析技术。这些技术包括实时分析技术（AFM、QCM-D和SPR）、非破坏性方法（FLS、FTIR-ATR和NMR）以及原子水平的MD模拟。本综述对每种方法的背景、原理和在该领域的相关应用进行了总结。

本综述中，南京林业大学大学博士生赵晓雪和美国田纳西大学Xianzhi Meng为共同第一作者，南京林业大学黄曹兴副教授和勇强教授为共同通讯作者。

背景介绍

在众多的生物炼制途径中，通过纤维素酶将木质纤维素水解成可发酵单糖是木质纤维生物转化过程中的关键一步。其中，酶与纤维素的直接接触是酶水解的必要前提。然而木质素与纤维素酶的非生产性结合，认为是阻碍纤维素可及性的顽固因素之一，其降低了糖化率和碳水化合物的得率，从而导致碳水化合物的糖化成本增加。尽管木质素对酶解的抑制作用非常重要，但其确切的抑制机理至今仍有争议，需要进一步阐明。

基于此，南京林业大学勇强教授课题组和美国田纳西大学Arthur J. Ragauskas教授课题组从不同的角度探讨了酶和木质素之间的相互作用，结合多学科分析技术，综述了目前国内外研究木质素-酶相互作用的常用先进分析方法。包括耗散石英晶体微天平(QCM-D)、表面等离子体共振(SPR)、傅立叶变换红外光谱-衰减全反射(FTIR-ATR)、原子力显微镜(AFM)，核磁共振(NMR)光谱，荧光光谱法(FLS)和分子动力学(MD)模拟。这些分析方法的跨学科整合旨在从细胞和原子水平为木质素和酶之间的相互作用提供新的见解。这一综述将为今后降低木质素对酶解的抑制作用和提高下游发酵糖最终产量的成本效益提供有用的信息。

图文解读

目前大多数关于酶-木质素相互作用的研究都集中在研究酶水解过程中不同类型木质素对酶的吸附行为。然而，酶与木质素的吸附能力和亲和力，受酶种类、吸附温度、缓冲溶液pH等实验条件的显著影响。由于一些先进的分析技术的快速发展，木质素-酶相互作用的表征有了显著的进展，本综述旨在介绍各种先进的研究技术及其原理和应用，旨在阐明酶与木质素相互作用的机理。

1. QCM-D

由于木质纤维结构的复杂特性，文献中的大多数研究都侧重于通过依赖一定时间酶解糖化后的总糖释放率来研究物木质素对酶水解的影响。然而，这些工作通常不能实时分析酶水解的动力学过程和界面相互作用。为了解决这些问题，应用QCM-D手段可以原位实时监测木质素与酶的吸附和解吸过程。该方法为进一步揭示木质素与酶相互作用动态模型提供一定基础。

图1. QCM-D在木质素-酶相互作用方面的应用

2. AFM

木质素与酶相互作用时，分离它们所需的力通常被称为为“粘附力”。AFM探针可以被修饰以具有特定的化学甚至生化特性，使得AFM以原子分辨率在纳米级，表征特定蛋白质分子和配体之间的相互作用力。也可用于表征从亚分子水平到细胞水平的各个领域的表面形态，该结果可以观察单个分子在生理环境中所经历的动态变化，并可以在分子水平上操纵聚合物，具体应用包括：蛋白质和蛋白质纤维的拉伸，以及生物分子之间相互作用力的测量。

图2. AFM在木质素-酶相互作用方面的应用

3. SPR

SPR是另一种可以模拟木质素-酶的吸附-解吸模型的技术。这是一种用于检测金属表面超薄吸附层厚度和结构变化的光学技术。Liedberg等人于1983年将SPR技术引入化学传感器，由于其具有灵敏度高、无需标和实时检测的特点，SPR技术已发展成为研究生物分子与其他配体分子相互作用的强大工具。如图所示，SPR技术可以用来确定目标生物分子是否可以结合到生物功能化传感器表面，以及结合行为的动力学。

图3. SPR在木质素-酶相互作用方面的应用

4. NMR

找寻木质素与酶相互作用的的结合位点是了解木质素-酶无效吸附的关键。尽管NMR技术被广泛应用于木质素与酶相互作用时木质素结构的变化，但酶结合木质素的确切位点尚未在分子水平上阐明。一般来说主要有两种方法，一是NOE法（Nuclear Overhauser Effect）,该法是重要的蛋白质结构解析方法之一，通过NOE获得蛋白质分子内官能团间距，之后通过电脑模拟得到分子的三维结构。第二种方法侧重于目标蛋白与配体结合后的化学位移变化。以酶的角度来分析，即NMR滴定分析，如化学位移扰动(CSP)，是在氨基酸残基分辨力下识别蛋白质底物结合位点的有效方法。

图4. NMR在木质素-酶相互作用方面的应用

5. ATR-FTIR

不同类型的酶可能具有不同的结构性质，这可能会影响酶解过程中对木质素的亲和力。然而，关于这种酶吸附到木质纤维素底物(如木质素)上时构象变化的研究非常有限。FTIR-ATR方法已被用于跟踪吸附在粒子表面的蛋白质构象的变化。此外，FTIR-ATR也是无标记和无损的，因此作为一种分析技术，提供蛋白质吸附行为的分子观察具有重要的潜力。

6. FLS

由于水解过程中水解酶的复杂性，生物质抗性领域的研究大多集中在木质素的理化性质上。但这些研究并不能直接监测酶解过程中酶活性的变化，特别是酶构象的变化。FLS能利用酶具有内源荧光的特点，通过现有方法的计算，得到木质素-酶的结合机理参数。同时，由于木质素具有荧光的特点，FLS技术在生物科学中的应用显著增加，其中包括但不限于预测生物质糖化，揭示木质素在植物细胞壁上的分布，以及生物质预处理过程中木质素的迁移规律。

图5. FLS在木质素-酶相互作用方面的应用

7. MD

利用量子化学或经典分子动力学模拟等计算技术，从原子水平上研究木质素等生物质组分的能量和结构特性，以及纤维素酶的动态结构信息，。这些信息对于了解木质素-酶相互作用的结构-功能关系和相互作用机理的基本原理具有重要意义。并最终指导酶的设计和木质素的改性过程，以减轻非生产性结合，找寻高效的纤维素解构过程。

图6. MD在木质素-酶相互作用方面的应用

结论

木质素与酶之间的非生产性吸附和/或空间位阻降低了酶解的效率，不同条件下木质素-酶的作用机制尚不清楚，不同研究结果之间甚至相互矛盾，从而加大了生物燃料商业推广的难度。由于木质素、植物细胞壁和酶系统的结构复杂性，需要结合上述技术来准确描述木质素与酶的非生产性结合。相关研究有助于预处理方法的选择和优化，甚至对酶基因的修饰提供参考，从而提高酶水解效率，以减轻木质纤维素生物质的生物降解阻力。希望通过该综述，强调各种分析技术的最新进展，同时，一种可以解决木质素-酶结合的多个方面的单一分析技术是迫切需要的。

原文链接

https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2021.107830

往期推荐

本公众号现全面开放投稿，希望文章作者讲出自己的科研故事，分享论文的精华与亮点。投稿请联系小编（微信号：biomass12345）

为了增加生物质领域科研人员的交流与合作，我们编辑部目前组建了生物质前沿微信交流群，欢迎相关领域研究人员入群讨论，共同进步。

进群方式：添加小编为好友（微信号：biomass12345），邀请入群。

请备注：姓名+单位+研究方向。

另外，本公众号还友情为国内外有需求的实验室免费发布招聘信息，也可为学术机构发布相关学术会议信息。